III. Otras disposiciones. CONSEJO DE SEGURIDAD NUCLEAR. Comunidad Autónoma de Cataluña. Convenio. (BOE-A-2020-7129)
Resolución de 24 de junio de 2020, del Consejo de Seguridad Nuclear, por la que se publica el Convenio con la Universidad Autónoma de Barcelona, para la ejecución del proyecto "Susceptibilidad individual de riesgo asociado con la edad ante exposición a dosis bajas y moderadas de radiación".
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No ocultamos, cambiamos o tergiversamos la información, simplemente somos un altavoz organizado de los boletines oficiales de España.
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BOLETÍN OFICIAL DEL ESTADO
Núm. 182
Jueves 2 de julio de 2020
Sec. III. Pág. 46674
en apartados anteriores (hTERT, SV40-LT/st y H-Ras) son capaces de generar tumores de
tipo adenocarcinoma en ratones inmunodeprimidos.
3.2 Transformación experimental premaligna de las células.
La transformación de células epiteliales derivadas de glándula mamaria normal
requiere la introducción de los tres elementos genéticos: hTERT, SV40-LT/st y H-Ras. Con
el fin de investigar el potencial carcinogénico de las células expuestas a dosis bajas y
moderadas de radiación, obtendremos células premalignas mediante la transducción de
BPECs normales con una combinación incompleta de los tres elementos genéticos (solo
hTERT + SV40-LT/st) (Tarea 1). El análisis de las células pre-transformadas permitirá
evaluar la susceptibilidad a la transformación como consecuencia de la exposición a
radiación. Las transducciones se realizarán de forma secuencial con vectores virales de
tipo lentiviral que contengan cada uno de los genes de interés (hTERT, SV40-LT/st)
asociado al gen de una proteína fluorescente (CherryFP, GreenFP). La proteína
fluorescente va a permitir seleccionar las poblaciones celulares que hayan incorporado el
transgen. De hecho, gracias a una colaboración con el equipo de investigación del Servicio
de Vectores del Centro de Investigaciones Cardiológicas de Madrid, se han clonado ya las
tres construcciones genéticas (h-TERT-ChFP, SV40-LT/st-GFP y H-Ras-CFP) para la
construcción de los vectores lentivirales. La eficiencia de los procedimientos de
transducción se controlará valorando en las células infectadas la expresión de hTERT,
p53, pRb y H-Ras tanto a nivel de mRNA (con qRT-PCR) como a nivel de proteína
(Western blot) (Tarea 2). La irradiación de las células premalignas (h-TERT-ChFP–
SV40-LT/st-GFP) se realizará con dosis entre 0,1-0,2 Gy y 2 Gy. En todos los experimentos
se utilizaran las células completamente transformadas (h-TERT-ChFP–SV40-LT/st-GFP–
H-Ras-CFP) como control positivo.
Ensayos para valorar la transformación celular maligna radioinducida.
Para analizar el efecto carcinogénico de la exposición a dosis bajas y moderadas de
radiación en células premalignas se realizarán en primer lugar ensayos de proliferación
independiente de anclaje (Tarea 3). Los resultados de este ensayo son valiosos dado que
sólo las células capaces de proliferar en estas condiciones son capaces de generar
tumores en ratones inmunodeprimidos. Brevemente, el ensayo consiste en cultivar un
número limitado de células en agar blando (medio de cultivo al 0,3% de agar). Esta baja
concentración de agar evita el anclaje de las células al substrato y las mantiene
individualizadas. Pasados 21 días se analiza mediante la tinción con MTT la presencia de
colonias de células vivas que hayan sido capaces de proliferar. Teniendo en cuenta el
número de células sembradas y el número de colonias vivas, se calcula la eficiencia de la
proliferación celular independiente de anclaje, que constituye una medida del grado de
transformación radioinducida que han sufrido las células.
El segundo ensayo para valorar la transformación celular inducida por radiación se
realizará mediante el cultivo de las células irradiadas en una matriz rica en laminina y
colágeno (Matrigel). En estas condiciones las células epiteliales derivadas de la glándula
mamaria normal se dividen un número limitado de veces y sufren procesos de apoptosis
selectivos que dan lugar a estructuras esféricas, huecas y polarizadas parecidas a los
acinos de la glándula mamaria. A diferencia de las células epiteliales mamarias normales,
las células epiteliales transformadas proliferan de manera ilimitada cuando se cultivan en
Matrigel y forman estructuras desorganizadas similares a los tumores de mama, que se
caracterizan por la pérdida de la polaridad apicobasal y por la repoblación celular del
lumen central (Weigelt y Bissel, 2008). El cultivo de las células premalignas irradiadas en
Matrigel nos permitirá detectar cambios indicativos de transformación maligna, tales como
los que afectan la morfología de las estructuras acinares, su polaridad o la proliferación
celular (Tarea 4). La pérdida de polarización de las estructuras acinares se analizará
mediante la detección de laminina V, claudina 4 y citoqueratina K14. Los cambios en la
proliferación celular serán analizados con Ki67. Por último, la presencia de células
apoptóticas se detectará con anticuerpos anti-caspasa.
cve: BOE-A-2020-7129
Verificable en https://www.boe.es
3.3
Núm. 182
Jueves 2 de julio de 2020
Sec. III. Pág. 46674
en apartados anteriores (hTERT, SV40-LT/st y H-Ras) son capaces de generar tumores de
tipo adenocarcinoma en ratones inmunodeprimidos.
3.2 Transformación experimental premaligna de las células.
La transformación de células epiteliales derivadas de glándula mamaria normal
requiere la introducción de los tres elementos genéticos: hTERT, SV40-LT/st y H-Ras. Con
el fin de investigar el potencial carcinogénico de las células expuestas a dosis bajas y
moderadas de radiación, obtendremos células premalignas mediante la transducción de
BPECs normales con una combinación incompleta de los tres elementos genéticos (solo
hTERT + SV40-LT/st) (Tarea 1). El análisis de las células pre-transformadas permitirá
evaluar la susceptibilidad a la transformación como consecuencia de la exposición a
radiación. Las transducciones se realizarán de forma secuencial con vectores virales de
tipo lentiviral que contengan cada uno de los genes de interés (hTERT, SV40-LT/st)
asociado al gen de una proteína fluorescente (CherryFP, GreenFP). La proteína
fluorescente va a permitir seleccionar las poblaciones celulares que hayan incorporado el
transgen. De hecho, gracias a una colaboración con el equipo de investigación del Servicio
de Vectores del Centro de Investigaciones Cardiológicas de Madrid, se han clonado ya las
tres construcciones genéticas (h-TERT-ChFP, SV40-LT/st-GFP y H-Ras-CFP) para la
construcción de los vectores lentivirales. La eficiencia de los procedimientos de
transducción se controlará valorando en las células infectadas la expresión de hTERT,
p53, pRb y H-Ras tanto a nivel de mRNA (con qRT-PCR) como a nivel de proteína
(Western blot) (Tarea 2). La irradiación de las células premalignas (h-TERT-ChFP–
SV40-LT/st-GFP) se realizará con dosis entre 0,1-0,2 Gy y 2 Gy. En todos los experimentos
se utilizaran las células completamente transformadas (h-TERT-ChFP–SV40-LT/st-GFP–
H-Ras-CFP) como control positivo.
Ensayos para valorar la transformación celular maligna radioinducida.
Para analizar el efecto carcinogénico de la exposición a dosis bajas y moderadas de
radiación en células premalignas se realizarán en primer lugar ensayos de proliferación
independiente de anclaje (Tarea 3). Los resultados de este ensayo son valiosos dado que
sólo las células capaces de proliferar en estas condiciones son capaces de generar
tumores en ratones inmunodeprimidos. Brevemente, el ensayo consiste en cultivar un
número limitado de células en agar blando (medio de cultivo al 0,3% de agar). Esta baja
concentración de agar evita el anclaje de las células al substrato y las mantiene
individualizadas. Pasados 21 días se analiza mediante la tinción con MTT la presencia de
colonias de células vivas que hayan sido capaces de proliferar. Teniendo en cuenta el
número de células sembradas y el número de colonias vivas, se calcula la eficiencia de la
proliferación celular independiente de anclaje, que constituye una medida del grado de
transformación radioinducida que han sufrido las células.
El segundo ensayo para valorar la transformación celular inducida por radiación se
realizará mediante el cultivo de las células irradiadas en una matriz rica en laminina y
colágeno (Matrigel). En estas condiciones las células epiteliales derivadas de la glándula
mamaria normal se dividen un número limitado de veces y sufren procesos de apoptosis
selectivos que dan lugar a estructuras esféricas, huecas y polarizadas parecidas a los
acinos de la glándula mamaria. A diferencia de las células epiteliales mamarias normales,
las células epiteliales transformadas proliferan de manera ilimitada cuando se cultivan en
Matrigel y forman estructuras desorganizadas similares a los tumores de mama, que se
caracterizan por la pérdida de la polaridad apicobasal y por la repoblación celular del
lumen central (Weigelt y Bissel, 2008). El cultivo de las células premalignas irradiadas en
Matrigel nos permitirá detectar cambios indicativos de transformación maligna, tales como
los que afectan la morfología de las estructuras acinares, su polaridad o la proliferación
celular (Tarea 4). La pérdida de polarización de las estructuras acinares se analizará
mediante la detección de laminina V, claudina 4 y citoqueratina K14. Los cambios en la
proliferación celular serán analizados con Ki67. Por último, la presencia de células
apoptóticas se detectará con anticuerpos anti-caspasa.
cve: BOE-A-2020-7129
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